細胞培養過程中的【載體選擇】

【微載體(ti) 】

微載體(ti) 指直徑在60-250μm，能適用於(yu) 貼壁細胞生長的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成，較傳(chuan) 統二維平麵基質可提供更大的細胞貼附麵積，另外，利用微載體(ti) 可以實現貼壁細胞的懸浮培養(yang) 並借助开云体育首页實現貼壁細胞的規模化生產(chan) ，節省人力、物力和空間。

據GIR (Global Info Research)調研，按收入計，2021年全球微載體(ti) 收入大約1062.9百萬(wan) 美元，預計2028年達到1321.3百萬(wan) 美元，2022至2028期間，年複合增長率CAGR為(wei) 3.2%。調研預測顯示微載體(ti) 的未來需求大規模擴增，但麵對市場上琳琅滿目的載體(ti) ，我們(men) 如何進行選擇呢？

下麵我們(men) 將從(cong) 幾個(ge) 方麵進行簡單介紹，幫助大家對微載體(ti) 細胞培養(yang) 有更多了解。

【載體(ti) 結構與(yu) 材質】

① 結構：

通常分為(wei) 固體(ti) 微載體(ti) （實心微載體(ti) 和多孔微載體(ti) ）和液體(ti) 微載體(ti) 。

圖1：固體(ti) 微載體(ti) 的分類及優(you) 、劣勢分析（點擊查看大圖）

② 材質：

微載體(ti) 的製造材料也是細胞培養(yang) 中的⼀個(ge) 關(guan) 鍵因素，因為(wei) 它對細胞有物理和化學作⽤，包括孔隙率、機械強度、營養(yang) 物質的滲透性、尺⼨、密度和形狀【2】。

▷ 人工合成的高分子材料：

例如聚苯乙烯微載體(ti) 、中空玻璃微載體(ti) 、聚苯烯酞胺微載體(ti) 等；

▷ 天然來源的高分子材料：

例如交聯明膠微載體(ti) 、纖維素微載體(ti) 、殼聚糖微載體(ti) 、海藻酸、透明質酸等；

▷ 其他無機材料：

例如玻璃微載體(ti) 等。

【貼壁依賴的動物細胞在微載體(ti) 上貼壁、增殖和收獲】

① 微載體(ti) 影響細胞貼附的因素【2】

（1）細胞與(yu) 微載體(ti) 的相融性

細胞與(yu) 微載體(ti) 的相容性主要與(yu) 微載體(ti) 基質表麵的化學、物理性質相關(guan) 。一般細胞在進入生理pH值時，表麵帶負電荷。若微載體(ti) 帶正電荷，則利用靜電引力可加快細胞貼壁速度。若微載體(ti) 帶負電荷，因靜電斥力使細胞難於(yu) 黏附貼壁，但培養(yang) 液中溶有或微載體(ti) 表麵吸附著二價(jia) 陽離子作為(wei) 媒介時，則帶負電荷的細胞也能貼附。

市場上常見的傳(chuan) 統微載體(ti) 采用的基本基質，如聚苯乙烯、葡聚糖、玻璃等聚合物為(wei) 電中性的材質，無法支持細胞貼壁，因此通常修飾正電荷或化學鍵合，以促進具有不均勻表⾯負電荷分布的貼壁細胞的附著。⽽具有較⾼電荷密度的微載體(ti) 被開發⽤於(yu) 促進弱細胞係的細胞粘附（例如 Cytopore 1 和 2）。

▷ 微載體(ti) 表麵的化學修飾：

△ 將化學基團結合到載體(ti) 表麵是一種常見的方法（原理通過改變載體(ti) 表麵電荷的親(qin) 水性或疏水性）如氨基、伯胺、叔胺和三⼄胺等基團等改變載體(ti) 表麵電性或羧基化、羥基化提高微載體(ti) 親(qin) 水性；

△ 引入含相關(guan) 細胞貼附位點的蛋白，如：纖連蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白等。

（2）載體(ti) 表麵物理特征，包括形貌和粗糙度，如多孔或者實心。

（3）取決(jue) 於(yu) 細胞與(yu) 微載體(ti) 接觸的幾率

▷載體(ti) 、細胞的接種密度；

▷ 攪拌條件：較低的攪拌速度利於(yu) 細胞的接種，而MSC更適合減速接種【2】

② 細胞在微載體(ti) 表麵的增殖的影響因素

影響細胞在微載體(ti) 表麵增殖或分化的因素很多，主要有三個(ge) 方麵。

（1）在細胞方麵：如細胞群體(ti) 、活性、狀態和類型。

（2）在微載體(ti) 方麵：如微載體(ti) 表麵的生化性能、吸附的大分子和離子；微載體(ti) 表麵光滑時細胞擴展快，表麵多孔則擴展慢；表麵物理特征如剛度和彈性模量、形貌等均會(hui) 影響細胞的增殖或分化。文獻報道剛性表麵剛度在34Kpa時會(hui) 導致MSCs呈紡錘狀並向骨分化，表麵為(wei) 1Kpa的低剛度則促進了軟骨、脂肪、神經元分化，而中等表麵剛度則促進向肌肉分化【2】。

（3）在培養(yang) 環境中：如培養(yang) 基組成、溫度、pH、氧以及代謝廢物等均明顯影響細胞在微載體(ti) 上的生長。如果所處條件***，則細胞生長快；反之生長速度慢。

③ 貼壁依賴的動物細胞在微載體(ti) 上的收獲：

容易收獲細胞或細胞製品是優(you) 秀微載體(ti) 的一個(ge) 關(guan) 鍵指標，同時也是用戶選擇載體(ti) 的關(guan) 鍵指標之一。

目前市麵上常規的傳(chuan) 統微載體(ti) 主要采用聚苯⼄烯、葡聚糖、纖維素或玻璃等不可溫和降解的聚合物作為(wei) 微載體(ti) 的基本基質。因此在培養(yang) 結束時，較難將細胞與(yu) 微載體(ti) 充分分離成為(wei) 這些微載體(ti) 在細胞收獲過程中需要突破的挑戰【2】。尤其市麵上常規的微載體(ti) 通過表麵修飾增強了電荷，依靠電荷提供較強的細胞貼壁效果，這使得在細胞分離時需要較強的酶消化強度和時間，而且不能令細胞消化下來，如此導致較大的細胞損失和細胞損傷(shang) 。

另一方麵，不可降解的微載體(ti) 與(yu) 細胞均為(wei) 固體(ti) 物質，僅(jin) 靠常規離心無法分離，需要額外的梯度離心或者過濾的方法將微載體(ti) 去除以獲得細胞，增加了整個(ge) 生產(chan) 過程的成本和過程的複雜性，降低了細胞回收率和活性。更進一步的，所收獲的細胞用於(yu) 治療存在安全隱患，因為(wei) 微載體(ti) 顆粒若無法得到有效去除，其殘留將導致後續細胞製品注射體(ti) 內(nei) 將引起血管堵塞或者異物排斥等安全性問題。

【應針對不同應用選擇適合的微載體(ti) 】

綜上不難發現細胞能否在微載體(ti) 表麵附著生長並擴展取決(jue) 於(yu) 細胞的特性、微載體(ti) 理化性質、培養(yang) 基成分及培養(yang) 條件。而微載體(ti) 性能的優(you) 良與(yu) 否是關(guan) 鍵的因素，它不僅(jin) 影響培養(yang) 細胞的形態、貼壁率、生長速率、細胞密度以及是否容易收獲細胞或其分泌產(chan) 物，乃至於(yu) 產(chan) 物的整個(ge) 生產(chan) 成本。

針對不同的細胞類型不僅(jin) 要篩選合適的微載體(ti) ，也需要合適的接種條件及培養(yang) 條件，而對於(yu) 大多數細胞培養(yang) 研發和生產(chan) 的企業(ye) 來說，對各類型微載體(ti) 的認識不是很***，在選擇過程中有很多關(guan) 鍵的因素根本考慮不到。

目前華龕生物能夠提供基於(yu) 不同細胞在微載體(ti) 上從(cong) 接種、培養(yang) ，到體(ti) 係放大和收獲等一整套解決(jue) 方案。廣泛應用於(yu) 細胞治療、病毒疫苗、基因工程和組織工程等領域。

【實例】

① 生物醫藥領域的微載體(ti) 應用現狀——細胞治療領域

間充質⼲細胞的臨(lin) 床應⽤需要數⼗億(yi) 個(ge) 細胞和⼆維平台，這可能對擴⼤規模構成挑戰。

為(wei) 了在細胞移植和組織⼯程應⽤中獲得可 擴展的未分化間充質⼲細胞數量，與(yu) ⼆維培養(yang) 相⽐，三維培養(yang) 技術是⼀種更***的⽅法【2】。

例如：華龕生物利用原創3D TableTrix®W係列多孔可降解微載體(ti) 、僅(jin) 針對載體(ti) 的裂解液結合自動化开云体育首页和細胞收獲裝置可實現一次1010級別的間充質幹細胞製劑產(chan) 量。

② 生物醫藥領域的微載體(ti) 的應用現狀——病毒疫苗領域(vero細胞)【3】

文中提出已經工業(ye) 化的微載體(ti) 技術為(wei) 使用 Vero 細胞係生產(chan) 病毒提供了一個(ge) 強大的平台，但實現更高的病毒生產(chan) 力，該平台麵臨(lin) 著一些挑戰。與(yu) 生物工藝相比與(yu) 其他動物細胞係相比，Vero 細胞密度仍然相對較低，一般不超過 107 個(ge) 細胞/mL（圖3）。

文中給出的解決(jue) 方案：

（1）更深入的研究：分析高細胞濃度下 Vero 細胞的狀態（代謝組學、轉錄組學和蛋白質組織學等方麵充分的研究）。

（2）更合適得培養(yang) 策略：實時的營分和待測物濃度檢測，並且及時的供給及排出【3】。

實際上，目前華龕已經實現使用3D TableTrix®V係列可高溫滅菌微載體(ti) ，配合3D FloTrix®vivaSPIN 自動化开云体育首页，在微載體(ti) 4g/L~10g/L的條件下，連續培養(yang) 一周的時間即可獲得1×107cells/mL的較高細胞培養(yang) 密度。Vero細胞在微載體(ti) 上，有較好的貼附能力，該細胞密度滿足於(yu) 疫苗的大量生產(chan) 並且已有相關(guan) 研究數據顯示其產(chan) 毒效率亦顯著高於(yu) 傳(chuan) 統微載體(ti) （圖4）。

圖4：使用不同類型微載體(ti) 培養(yang) Vero細胞產(chan) 生的某病毒滴度對比

參考文獻

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