畢赤酵母表達係統及發酵工藝

一、畢赤酵母表達係統簡介

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達係統作為(wei) 一種高效的真核表達係統，畢赤酵母表達係統具有廣泛的應用領域和顯著的優(you) 勢。與(yu) 其他表達係統相比，畢赤酵母表達係統的優(you) 勢明顯。它擁有目前強、調控機理嚴(yan) 格的啟動子之一 —— 醇氧化酶基因 AOX1 啟動子，這使得外源基因的表達調控更加精準高效。其表達水平高，既能實現胞內(nei) 表達，又可進行分泌型表達，極大地滿足了不同研究和生產(chan) 的需求。發酵工藝成熟且易於(yu) 放大，已經具備大規模工業(ye) 化高密度生產(chan) 的能力，為(wei) 產(chan) 業(ye) 化發展提供了便利條件。培養(yang) 成本低，產(chan) 物易分離，所用發酵培養(yang) 基廉價(jia) ，且不含蛋白，有利於(yu) 下遊產(chan) 品的分離純化，降低了生產(chan) 成本。外源蛋白基因遺傳(chuan) 穩定，整合到畢赤酵母染色體(ti) 上後，能隨染色體(ti) 複製而穩定存在，不易丟(diu) 失。此外，作為(wei) 真核表達係統，畢赤酵母還具有真核生物的亞(ya) 細胞結構，能夠對表達的蛋白進行糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻譯後修飾加工，使表達出的蛋白在結構和功能上更接近天然蛋白，具有更高的生物活性。

二、畢赤酵母表達係統構成

1、宿主菌

目前用於(yu) 外源蛋白表達的畢赤酵母宿主菌有： Mut+甲醇利用型GS115、X-33、SMD1165、SMD1163及 SMD1168等大多宿主菌；MutS甲醇利用緩慢型KM71； Mut-甲醇不利用型MC100-3。詳見下表，詳細地列舉(ju) 了畢赤酵母不同的表達宿主菌及表達特點

表 1常見的畢赤酵母表達宿主菌及特點

2、載體(ti)

畢赤酵母表達載體(ti) 以整合型載體(ti) 為(wei) 主，常見載體(ti) 可分為(wei) 胞內(nei) 表達載體(ti) 和分泌表達載體(ti) 。

表 2 常見的畢赤酵母表達宿載體(ti) 及特點

三、畢赤酵母發酵工藝

1、畢赤酵母發酵階段

畢赤酵母的發酵一般分兩(liang) 個(ge) 階段：1、細胞增長階段：首先在碳源為(wei) 甘油或葡萄糖的培養(yang) 基中進行的生長階段，積累足夠的細胞密度和生物量，在菌體(ti) 濃度達到一定階段時，當甘油或葡萄糖耗盡時，會(hui) 導致溶解氧值突然上升至100%左右，然後開始流加甘油或葡萄糖溶液，並保持通風量和攪拌速度，以維持溶解氧水平在30%左右，進一步增長生物量（菌濃）。2、誘導階段：當生物量達到要求後，停止補碳源，碳源耗盡，過渡期結束後，將碳源切換至甲醇進行誘導表達目標蛋白的發酵階段。一般間歇加入0.3%甲醇兩(liang) 次誘導，然後開始流甲甲醇誘導表達蛋白，這種方式可以提高外源蛋白的表達水平，並且使得畢赤酵母在較短時間內(nei) 積累高濃度的目標蛋白。

誘導表達階段是畢赤酵母發酵生產(chan) 過程中的關(guan) 鍵環節，在此階段，甲醇被用作特異性誘導劑，替代先前的碳源。畢赤酵母中的醇氧化酶基因（如 AOX1）在甲醇存在下被激活，從(cong) 而驅動外源基因的高效表達。該階段的條件控製對於(yu) 外源蛋白的產(chan) 量和質量具有重要影響，需要嚴(yan) 格控製甲醇的添加量、添加速率以及發酵環境的溫度、pH 值和溶氧量等參數，以確保外源基因能夠持續、高效地表達，同時避免甲醇對細胞產(chan) 生毒性以及其他不利影響。

2、發酵培養(yang) 基的種類和配方

畢赤酵母發酵培養(yang) 基的種類多樣，不同的培養(yang) 基配方適用於(yu) 不同的發酵階段和目的。

BSM（基礎鹽）培養(yang) 基是畢赤酵母發酵常用的基礎培養(yang) 基之一，其典型配方為(wei) ：85％磷酸 26.7ml/l，二水硫酸鈣 0.93g/l，硫酸鉀 18.2g/l，七水硫酸鎂 14.9g/l，氫氧化鉀 4.13g/l，甘油 40.0g/l，PTM1 4.35ml/l。這種培養(yang) 基能夠為(wei) 畢赤酵母的生長提供基本的營養(yang) 成分，包括氮源、磷源、鉀源、鎂源等無機鹽以及甘油作為(wei) 碳源，PTM1 則補充了酵母生長所需的微量元素和維生素等營養(yang) 物質，有助於(yu) 維持酵母細胞的正常生長和代謝。

F22 培養(yang) 基也是一種常見的畢赤酵母發酵培養(yang) 基，其配方在不同的研究和生產(chan) 應用中可能會(hui) 有所調整，但一般包含適量的碳源（如葡萄糖或甘油）、氮源（如酵母提取物、蛋白腖等）、無機鹽（如硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鉀等）以及其他添加劑（如生物素、微量元素溶液等）。與(yu) BSM 培養(yang) 基相比，F22 培養(yang) 基在營養(yang) 成分的組成和比例上可能有所優(you) 化，以滿足特定的發酵需求，例如在某些情況下可能更有利於(yu) 提高外源蛋白的表達量或改善蛋白的質量。

除了上述兩(liang) 種常見的培養(yang) 基外，還有許多其他的畢赤酵母發酵培養(yang) 基，這些培養(yang) 基的配方往往是根據具體(ti) 的實驗目的、菌株特性以及發酵工藝的要求進行優(you) 化和調整的。例如，在一些研究中，為(wei) 了提高畢赤酵母對特定底物的利用效率或增強其對環境壓力的耐受性，會(hui) 在培養(yang) 基中添加一些特殊的成分，如氨基酸、有機酸、多糖等；或者通過調整培養(yang) 基中碳源、氮源和無機鹽的比例，來優(you) 化酵母細胞的生長和代謝途徑，從(cong) 而實現更高的發酵效率和產(chan) 物產(chan) 量。

3、發酵工藝參數

在畢赤酵母發酵過程中，工藝參數的精確控製對於(yu) 發酵的成功與(yu) 否起著至關(guan) 重要的作用，這些參數包括 pH、溫度、溶氧等，它們(men) 相互關(guan) 聯、相互影響，共同決(jue) 定了畢赤酵母的生長狀況、代謝活性以及外源蛋白的表達水平。

pH值：是影響畢赤酵母發酵的關(guan) 鍵因素之一。畢赤酵母在不同的生長階段和代謝過程中，對 pH 值的要求有所不同。在細胞生長階段，一般適宜的 pH範圍為(wei) 5.0 - 6.0，在此 pH 條件下，酵母細胞能夠保持良好的生長狀態，酶的活性也能得到較好的發揮，有利於(yu) 細胞的增殖和代謝產(chan) 物的積累。pH值在畢赤酵母的發酵過程中，不僅(jin) 會(hui) 影響菌體(ti) 的生長狀態，而且對外源蛋白的表達也會(hui) 產(chan) 生重要影響。pH值對畢赤酵母的影響主要包括以下方麵：（1)影響細胞內(nei) 酶的活性，進而影響細胞的新陳代謝，從(cong) 而使外源蛋白的表達也受到影響；(2)影響細胞膜的通透性，對細胞吸收營養(yang) 物質和排出代謝產(chan) 物時產(chan) 生一定的影響；（3)pH值會(hui) 對培養(yang) 基中成分和細胞的代謝產(chan) 物的離解產(chan) 生影響，從(cong) 而對細胞吸收營養(yang) 物質造成影響；（4)pH值也可能對細胞的代謝過程產(chan) 生影響，使細胞代謝產(chan) 物的含量發生改變另外，在高密度發酵過程中，為(wei) 了減少外源蛋白被蛋白酶降解，應避開蛋白酶作用的最適pH值，將pH 值設定在偏離外源蛋白等電點處，也會(hui) 提高外源蛋 白的收獲率。

溫度：對畢赤酵母的生長和代謝也具有顯著影響。畢赤酵母的生長溫度一般在 28 - 30℃之間較為(wei) 適宜。在這個(ge) 溫度範圍內(nei) ，酵母細胞的生長速度較快，代謝活動旺盛，能夠高效地利用培養(yang) 基中的營養(yang) 物質進行生長和繁殖。然而，如果溫度過高，超過 32℃，可能會(hui) 導致細胞死亡，因為(wei) 高溫會(hui) 破壞細胞的膜結構、蛋白質和核酸等生物大分子的穩定性，從(cong) 而影響細胞的正常生理功能。相反，在較低的溫度下，雖然細胞的生長速度會(hui) 減慢，但一些研究表明，適當降低培養(yang) 溫度可以改善靶蛋白的產(chan) 量和質量。這是因為(wei) 低溫可以降低細胞內(nei) 蛋白質折疊的應力，減少錯誤折疊的發生，同時也能減少蛋白酶的活性，降低外源蛋白的水解程度，從(cong) 而有利於(yu) 外源蛋白的正確折疊和積累。

溶氧（DO）：是畢赤酵母發酵過程中另一個(ge) 關(guan) 鍵的工藝參數。畢赤酵母在利用甘油和甲醇進行生長和代謝時都需要氧氣的參與(yu) ，因此維持合適的溶氧水平對於(yu) 確保發酵的順利進行至關(guan) 重要。在整個(ge) 發酵過程中，通常需要將溶氧濃度維持在＞20% 的水平。在細胞生長初期，由於(yu) 菌體(ti) 數量較少，對氧氣的需求相對較低，此時通過適當的通氣和攪拌即可滿足細胞的溶氧需求。隨著細胞的生長和代謝活動的增強，對氧氣的消耗逐漸增加，此時需要進一步調整通氣量、攪拌速度或采用純氧補充等方式來提高溶氧水平，以保證細胞能夠獲得足夠的氧氣進行代謝。如果溶氧不足，可能會(hui) 導致細胞生長緩慢、代謝產(chan) 物積累減少，甚至會(hui) 引起細胞死亡，從(cong) 而嚴(yan) 重影響發酵的效率和產(chan) 物的產(chan) 量。

培養(yang) 時間：是在畢赤酵母表達係統中獲得最高蛋白表達水平的最關(guan) 鍵因素之一，在畢赤酵母表達係 統中，生產(chan) 時間相對較長（約100h）。培養(yang) 時間與(yu) 酵母細胞的數量和目標蛋白的降解程度有關(guan) ，有研 究表明，巴斯德畢赤酵母細胞的最高生長密度是培 養(yang) 96h，而最高蛋白表達發生在48h［11]，這表明 較長的培養(yang) 時間很可能會(hui) 導致所表達蛋白被水解消 化，也有其他的研究表明最佳蛋白質表達時間發生 在培養(yang) 72~96 h[2

畢赤酵母發酵工藝是一個(ge) 複雜而精細的過程，需要對發酵階段、培養(yang) 基配方和工藝參數進行精確的控製和優(you) 化，可以通過實驗設計（DOE）方法，係統地優(you) 化發酵條件，如pH、溫度、溶氧和培養(yang) 基組成以充分發揮畢赤酵母的優(you) 勢，實現外源蛋白的高效表達和生產(chan) 。通過深入了解畢赤酵母的發酵特性和需求，結合先進的發酵技術和設備，不斷優(you) 化發酵工藝，有望進一步提高畢赤酵母發酵的效率和產(chan) 物質量。

四、畢赤酵母與(yu) 發酵罐的 “默契配合”

在畢赤酵母的發酵過程中，發酵罐作為(wei) 核心設備，為(wei) 畢赤酵母的生長和代謝提供了關(guan) 鍵的環境條件，確保其能夠高效表達外源蛋白。

發酵罐通過精確的溫度控製係統，為(wei) 畢赤酵母提供適宜的生長溫度。如前所述，畢赤酵母在 28 - 30℃的生長階段以及在誘導表達階段對溫度的特定要求，發酵罐的溫控係統能夠精準地維持在這些設定溫度範圍內(nei) ，避免溫度過高或過低對酵母細胞生長和蛋白表達的不利影響。在大規模發酵生產(chan) 中，這種精確的溫度控製尤為(wei) 重要，它保證了每一批次的畢赤酵母都能在穩定且適宜的溫度環境下生長，從(cong) 而提高了生產(chan) 的穩定性和重複性。

對於(yu) pH 值的調控，發酵罐配備了先進的 pH 檢測和調節裝置。在畢赤酵母發酵的不同階段，根據其對 pH 值的需求變化，發酵罐能夠自動添加酸堿溶液，將 pH 值精確維持在所需範圍內(nei) 。在細胞生長階段保持 pH 5.0 - 6.0，誘導表達階段調整到 3.0 - 5.0，這種精準的 pH 控製有助於(yu) 維持酵母細胞內(nei) 酶的活性，促進細胞的正常生長和代謝，同時減少外源蛋白的降解，提高蛋白的產(chan) 量和質量。

溶氧水平的控製也是發酵罐的關(guan) 鍵功能之一。畢赤酵母在發酵過程中對溶氧需求較高，發酵罐通過合理的通氣係統和攪拌裝置，確保溶氧濃度始終維持在＞20% 的水平。通氣係統能夠向發酵液中均勻地通入空氣或氧氣，而攪拌裝置則通過不斷攪拌，使氧氣在發酵液中充分分散，提高氧氣的傳(chuan) 遞效率，滿足畢赤酵母在不同生長階段對氧氣的需求，保證其代謝活動的正常進行，進而促進外源蛋白的高效表達。

攪拌和通氣係統的協同作用還能保證發酵液中的營養(yang) 物質均勻分布，避免出現局部營養(yang) 缺乏或過剩的情況，使每一個(ge) 畢赤酵母細胞都能在良好的營養(yang) 環境下生長。同時，發酵罐的密封性能也十分重要，它能夠防止外界雜菌的汙染，確保畢赤酵母發酵過程的純淨性和穩定性，避免因染菌而導致的發酵失敗或產(chan) 物質量下降等問題。

錦維生工的發酵罐產(chan) 品正是基於(yu) 這些關(guan) 鍵需求進行設計和製造的，擁有先進的溫度控製、pH 調節、溶氧控製以及高效的攪拌和通氣係統，能夠為(wei) 畢赤酵母的發酵提供優(you) 化的環境條件，幫助用戶實現高效、穩定的畢赤酵母發酵生產(chan) ，無論是在實驗室小試階段還是工業(ye) 大規模生產(chan) 中，都能發揮出的性能，滿足不同用戶對畢赤酵母發酵的各種需求，助力生物技術產(chan) 業(ye) 的蓬勃發展。我們(men) 將持續關(guan) 注畢赤酵母的研究動態和應用需求，不斷優(you) 化和創新發酵罐的設計與(yu) 製造技術，提升發酵罐的性能和穩定性，為(wei) 畢赤酵母的發酵生產(chan) 提供更加先進、高效的設備支持，共同推動生物技術產(chan) 業(ye) 邁向更加輝煌的未來。

錦維生工發酵罐介紹
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適用場合：原核/真核細胞的培養(yang) 和發酵和表達

培養(yang) 皿容積: 250ml/500ml/1L/3L/5L/10L

單元數量： 2-16聯

培養(yang) 方式： 懸浮&貼壁

槳葉類型： 三斜葉、六斜葉、六平葉、半管式、提升槳等多種組合

傳(chuan) 動方式：磁力耦合驅動/機械攪拌

控製策略：PID&階梯式控製策略（補料、攪拌轉速、溫度、通氣等）

補料控製：精確補料控製（誤差±1g）

功能特點：

界麵簡潔：幾分鍾掌握操作，事半功倍

無人值守：可遠程訪問、操作，實現無人值守

配方功能：配方一鍵下發，減少人員操作失誤，提高品質

數據分析：實現多批次數據對比，也可外接Doe&PAT實現深度多變量分析，優(you) 化工藝數據

數據分享：基於(yu) VPN的WEB發布，在保證數據安全和設備安全的情況下，實現移動端(androids、ioses、Windows)的監控和曆史曲線查看